Estado Demográfico y Marcaje Genético del Urogallo Cantábrico en el Noroeste de España

Introducción

Las poblaciones se consideran en peligro cuando son pequeñas, están en declive, o ambas cosas; son susceptibles a la estocasticidad ambiental y demográfica, a la pérdida de variabilidad genética y a la depresión endogámica [1], [2]. Además, la fragmentación a menudo aumenta el riesgo de extinción, ya sea directamente por la menor conectividad o indirectamente por los efectos Allee [3].

El urogallo cantábrico (Tetrao urogallus cantabricus), un galliforme forestal polígino que habita en el ecosistema forestal fragmentado del noroeste de España (Figura 1), es uno de los tetraónidos más amenazados [4]. Su área de distribución ha disminuido drásticamente desde principios de la década de 1980 [5], [6], y ha estado aislado el tiempo suficiente de otras poblaciones de urogallo como para ser considerado una Unidad Evolutiva Significativa [7]. La subespecie tiene un interés biogeográfico adicional debido a su ubicación en el borde posterior del área de distribución de la especie [8].

A principios de la década de 2000, se estimaron burdamente seiscientos individuos en un área de ocupación de 1700 km² [4]. Desde entonces, datos no publicados sugieren que la presencia actual de urogallo en las partes oriental y central de su área de distribución (Figura 1B) es, como mucho, precaria. Sin embargo, estas estimaciones de población se habían basado en observaciones directas, cuya precisión es debatible y dependiente del contexto (p. ej., [9], [10]). Generalmente, el sesgo es mayor en especies raras y esquivas [11]. Pero incluso en especies más conspicuas, los recuentos directos implican sesgos potenciales para los componentes más crípticos de la población (p. ej., [12], [13]).

El urogallo es un buen ejemplo: durante la temporada de cría, se congregan en las áreas de exhibición (leks), donde los machos dominantes exhiben y cortejan a las hembras, más pequeñas y menos llamativas [14]. Si las aves estaban exhibiéndose, un observador experimentado podría ver o escuchar a los machos dominantes, y quizás a algunas hembras. Sin embargo, los recuentos directos en las áreas de exhibición no son un método apropiado para detectar hembras, que tienen un plumaje críptico y asisten a estas áreas por períodos más cortos [14], [15], ni a machos subordinados o no reproductores [16]. Por lo tanto, los recuentos directos en las áreas de exhibición suelen subestimar los números reales en el urogallo [17].

Tamaño Poblacional y Marcaje Genético

El tamaño efectivo de la población demográfica (Ne) es aproximadamente equivalente al número de reproductores en un año determinado [18], y está fuertemente influenciado por la proporción de sexos y los sistemas de apareamiento [19], [20]. En especies políginas con comportamiento de exhibición (lekking), como el urogallo, unos pocos machos monopolizan el apareamiento [16], [21], lo que reduce notablemente Ne por debajo del número de adultos sexualmente maduros en la población. Las fluctuaciones en el tamaño de la población, la variabilidad en el éxito reproductivo individual y las proporciones de sexos desiguales son, por lo tanto, responsables de reducciones adicionales de Ne [18], [22], [23]. En última instancia, las poblaciones con un Ne bajo son más propensas a la extinción [24].

Se han desarrollado varios métodos basados en datos genéticos para calcular índices relacionados con Ne [25], [26]. Uno de ellos es el tamaño efectivo de la población genética (Ne gen), definido como el número de individuos reproductores en una población teórica que perdería diversidad genética a la misma velocidad que la población real que se está estudiando [27].

Ahora existen métodos de censo no invasivos basados en análisis de ADN, que "capturan" el material genético en lugar del individuo [29], [30]. Estos métodos aumentan las probabilidades de captura y, al mismo tiempo, reducen enormemente las perturbaciones. Las estimaciones genéticas se basan en la identificación individual de materiales dejados por el animal, como heces, plumas o pelos, una especie de marcaje molecular (p. ej., [31], [32]). Por lo tanto, los individuos pueden ser rastreados, y se han desarrollado métodos específicos para estimar la abundancia y el tamaño efectivo de la población, incluso a partir de una sola sesión de muestreo [33].

Metodología de Estudio

Realizamos un estudio genético de los urogallos cantábricos en una gran parte de su distribución existente utilizando genotipado multilocus de excrementos de urogallo como marcaje molecular individual. El urogallo cantábrico es una subespecie en peligro de extinción, y el acceso está restringido a áreas donde se han registrado exhibiciones primaverales. Las autoridades ambientales de Asturias y Castilla y León otorgaron los permisos necesarios para este estudio, que se basa únicamente en el muestreo no intrusivo de excrementos. El estudio fue diseñado específicamente para minimizar la perturbación del comportamiento del urogallo.

Cada sesión de muestreo fue realizada por dos personas, comenzando bien después de que las exhibiciones del urogallo hubieran terminado. Llevamos a cabo nuestro estudio en la parte occidental de la Cordillera Cantábrica, donde el urogallo habita en un paisaje montañoso con bosques altamente fragmentados [6], [34]. Exploramos algunos de los parches forestales menos perturbados, que combinaban una mayor idoneidad del hábitat y la presencia actual de urogallo [35] (Figura 1B). Definimos cinco zonas de estudio en el área de investigación, siguiendo esencialmente las principales subcuencas hidrográficas (Figura 1C, Tabla 1). Todas las zonas se encuentran en sitios designados como Red Natura 2000 (Directiva Hábitats 92/43/CEE). Además, tres de ellas (Leitariegos, Hermo y Degaña) también están incluidas en un parque regional, y la otra (Muniellos) es una reserva natural donde solo se permiten unas pocas visitas al día a lo largo de un sendero designado.

El muestreo tuvo lugar de abril a principios de junio de 2009, es decir, durante la temporada de apareamiento del urogallo cantábrico. Buscamos excrementos en parches forestales que incluían 52 áreas de exhibición previamente conocidas (es decir, sitios donde uno o más machos exhiben consistentemente para las hembras [37]). Nuestro estudio incluyó el 71% de todas las áreas de exhibición conocidas en el área de estudio con datos de ocupación desde el año 2000. Cada área de exhibición fue inspeccionada durante 2 a 3 horas por dos personas y la ubicación de cada muestra se registró con un GPS (±5m).

Seleccionamos los excrementos basándonos en su apariencia (tamaño, forma y contenido) y distancia (25 m para muestras de aspecto similar). Los excrementos se almacenaron en tubos con gel de sílice y se congelaron a -20°C hasta la extracción de ADN. Extraímos ADN genómico de un conjunto de 291 muestras distribuidas por toda el área de estudio (Figura 1C).

Análisis Genético

Se realizaron amplificaciones por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para 9 loci de microsatélites, desarrollados previamente para Tetrao urogallus (TUD2, TUD4, TUD5, TUT1, TUT3) y Tetrao tetrix (TTD2, TTD6, BG10, BG15) [38]-[40]. Las amplificaciones por PCR se realizaron en una mezcla de reacción de 10 µl que contenía 2 µl de ADN extraído, 1x tampón Taq (750 mM Tris-HCl, 200 mM (NH4)2SO4, 0.1% (v/v) Tween 20), 3 mM MgCl2, 0.2 mM de cada nucleótido, 4.2 pmoles de cada cebador, 0.108 µg/µl de BSA y 0.335 unidades de ADN polimerasa Taq (Fermentas). Las condiciones de PCR consistieron en 3 minutos a 94°C más 35 ciclos de 45 segundos de desnaturalización a 94°C, 45 segundos de hibridación a 54°C (para BG10 y BG15) o a 59°C (para el resto de los cebadores), 45 segundos de extensión a 72°C, y 5 minutos a 72°C para la extensión final.

Amplificamos los loci de microsatélites individualmente y se incluyeron controles negativos en todas las reacciones de amplificación. La extracción y amplificación se realizaron en laboratorios dedicados y separados. La extracción se confirmó amplificando un solo microsatélite (TUT1). Cuando una muestra no arrojó un resultado positivo, se realizó una segunda PCR. Cada muestra se amplificó de 2 a 7 veces para minimizar los errores de genotipado, siguiendo una modificación del enfoque de tubos múltiples [41], [42].

Para determinar el sexo de cada individuo identificado, utilizamos cebadores específicos para urogallo [43], derivados de la diferencia de tamaño del intrón específico del cromosoma en el gen CHD1 (ubicado en los cromosomas sexuales de las aves). Estos cebadores producen fragmentos cortos específicos del sexo (aproximadamente 200 pb) y funcionan bien con muestras de ADN degradado, como las de las heces. Los genotipos de consenso se determinaron siguiendo los mismos criterios que para los loci de microsatélites.

Control de Calidad y Estimación de Población

El genotipado se realizó en dos laboratorios (Laboratorio GECOBI, Argentina y Laboratorio de Ecología Molecular UMIB, España), utilizando dos máquinas de secuenciación diferentes: MegaBace 1000 Automated Sequencer (Argentina) y ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (España). Los microsatélites se genotiparon en tres multiplexes post-PCR, basados en rangos de tamaño de alelos y tintes fluorescentes. Cuando el genotipado se realiza en varios laboratorios y/o plataformas, es necesario calibrar y estandarizar la designación del tamaño de los alelos [44], [45].

Estandarizamos las puntuaciones de microsatélites con ADN de plantilla de muestras que contenían el rango completo de alelos encontrados en nuestra área de estudio. Establecimos reglas de estandarización siguiendo las recomendaciones de [45]. El dimensionamiento se verificó a doble ciego, utilizando dos paquetes de software diferentes: MegaBACE Fragment Profiler 1.2 software (Amersham Biosciences) y GeneMarker v1.3 (Soft Genetics LLC). Luego realizamos un re-cribado a doble ciego de todas las muestras en ambos laboratorios, para confirmar las reglas de estandarización, y se discutieron inconsistencias distintas de los cambios de tamaño. Cuando fue necesario, se realizaron nuevas amplificaciones y se volvieron a cribar las muestras.

La cantidad de ADN diana disponible en las muestras fecales suele ser baja, lo que aumenta los errores de genotipado [30], [41]. Los errores de genotipado (alelos falsos y abandono alélico) en cada locus a través de las PCR se verificaron utilizando GIMLET v.1.3.3 [47]. Con las tasas de error estimadas, comparamos los resultados de PCR independientes y el genotipo de consenso asociado para todas las muestras amplificadas, independientemente de si se incluyeron en el conjunto de datos final (es decir, 212 heces, ver Resultados). Utilizamos MICRO-CHECKER 2.2 [48] para comprobar el abandono de alelos grandes, el tartamudeo y los alelos nulos que pueden subestimar el número de individuos inflando la proporción de homocigotos.

Para comprobar el poder de los loci de microsatélites elegidos para identificar individuos, calculamos la probabilidad de que dos individuos, elegidos al azar de la población, compartieran el mismo genotipo multilocus (probabilidad de identidad, PID; [51]), incluso si fueran hermanos completos o tuvieran un alto grado de parentesco (PID-sib, [51]). Esta probabilidad depende del número de loci seleccionados utilizados para construir el genotipo, la variabilidad de estos loci y el parentesco de los individuos dentro de la población. Tanto PID como PID-sib para cada marcador, así como PID y PID-sib acumulativos para cada genotipo multilocus, se calcularon con GIMLET v.1.3.3 [47]. Consideramos que el riesgo de que dos individuos compartieran el mismo genotipo era insignificante si PID-sib (más conservador que PID) era inferior a 0.01, como se recomienda para nuestras estimaciones del tamaño de la población [51].

Para los resultados finales de identificación individual, utilizamos la prueba de diferencia en el historial de captura (DCH) y la prueba de examen de bimodalidad (EB) implementadas en DROPOUT [49], utilizando valores recomendados para PID y PID-sib [50] (ver más abajo). DCH examina si la tasa de adición de nuevos individuos al agregar más loci excede la esperada simplemente por el aumento de la resolución, también un signo típico de un posible error de genotipado. Para reducir el sesgo de sobreestimación debido a errores de genotipado, verificamos todos los pares de muestras que diferían en uno o dos alelos en un locus, o en dos alelos en uno o dos loci. Evaluamos los genotipos de consenso de estos pares de muestras con un "enfoque de coincidencia" [52]: para cada par, identificamos los alelos que coincidían y determinamos la probabilidad de obtener ese conjunto particular de coincidencias por casualidad a partir de dos urogallos diferentes. Si esta probabilidad es menor que PID-sib (ver más abajo), entonces asumimos que las muestras probablemente provenían del mismo individuo.

La fiabilidad de cada genotipo multilocus obtenido se determinó utilizando RELIOTYPE [53]. Solo las puntuaciones con una fiabilidad superior al 95% se consideraron "aceptables" sin análisis adicionales. Las muestras con puntuaciones más bajas se evaluaron utilizando información de los cebadores de sexo y la ubicación de los excrementos en el campo, siguiendo el enfoque propuesto por [54], adaptado a nuestro conjunto de datos y especie: cuando el genotipo de muestra "inaceptable" correspondía a una recaptura, es decir, cuando el genotipo era idéntico a los genotipos de otros excrementos, consideramos (1) si había consistencia en la determinación del sexo entre la muestra inaceptable y los otros excrementos que pertenecían al mismo genotipo (acuerdo de sexo), (2) si el excremento con el genotipo inaceptable se recolectó en la misma área de exhibición que otro excremento con genotipo idéntico (acuerdo de área de exhibición) y (3) si el excremento con el genotipo inaceptable se recolectó dentro de una distancia menor que la distancia máxima registrada en nuestro conjunto de datos entre muestras con el mismo genotipo (acuerdo de distancia). Si el excremento en cuestión superaba dos de las tres pruebas de acuerdo, se recodificó como "aceptable" y se mantuvo en la base de datos para análisis posteriores.

Resultados Principales

El número total de combinaciones alélicas únicas representa el número mínimo de individuos que habitan en el área (tamaño poblacional mínimo, Nmin), y proporciona una primera aproximación al tamaño real de la población. A partir de las muestras genotipadas, se pueden obtener estimaciones de captura-recaptura (CMR) específicamente desarrolladas para recapturas basadas en ADN [29]. A diferencia de los estudios CMR estándar, en los enfoques basados en ADN, un individuo puede ser capturado más de una vez por sesión (es decir, puede ser detectado en más de una muestra). Además, métodos específicos pueden estimar...

Estimación del Tamaño Poblacional y Características Demográficas

Utilizando la captura-mark-recapture (CMR) genética, estimamos una población de 93 individuos (Nc, IC del 95%: 70-116) en un área de aproximadamente 500 km².

La proporción de sexos se encontró sesgada hacia los machos (1:1.6).

El Ne gen estimado fue de 35.5, lo que representa el 38% de Nc. Este valor es notablemente más alto que el promedio publicado en poblaciones silvestres.

Esta población de urogallo es pequeña y se encuentra dentro de un rango preocupante en términos de viabilidad poblacional.

Movimientos y Marcaje Genético

Mediante el marcaje genético, detectamos principalmente movimientos de corta distancia; solo unos pocos machos fueron recapturados entre áreas de exhibición contiguas.

Conclusiones Preliminares

El estudio subraya la importancia de los métodos genéticos para evaluar el estado demográfico de especies esquivas y amenazadas como el urogallo cantábrico. Las estimaciones de tamaño poblacional y la proporción de sexos, junto con la evaluación del tamaño efectivo de la población genética, proporcionan información crucial para la conservación.

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